FAZA B+R

R&D phase

The HPV16 test in plasma is based on the blood in which there is DNA from the tumor. During carcinogenesis in which the main oncogenic factor is the HPV16 virus, a neoplastic cell is formed containing fragments of HPV16 DNA. In each cancer cell, HPV16 DNA is in multiple copies of the episomal form (viral DNA in an intact circular form) or integrates with genomic DNA (integrated form) or hybrid episomes are formed from previously integrated DNA (containing viral DNA and human DNA). Therefore, each cancer cell is equipped with an additional material, which is the DNA of the HPV16 virus, and the tumor modified in this way is called HPV-dependent cancer.

Research at the National Institute of Oncology, Branch in Gliwice, shows that HPV-dependent cancers account for approximately 60% of oropharyngeal cancers and 80% of anal cancers. In 2013-2015, an increase in the incidence of HPV-dependent cancers was observed in Poland, 5% for oropharyngeal cancer and 18% for anal cancer. In both of these tumors the most common genotype is type 16 (HPV16).

The validation of the plasma-based HPV16 test includes a description of the PCR test conditions, performance of the test process and statistical analyzes.

Description of the test conditions:

  • Defining the purpose of the method and its scope,
  • Characteristics of measuring and testing equipment and basic equipment PCR testing,
  • Characteristics of disposable consumables,
  • Description of standards, calibrators, reagents and control material,
  • Description of the test, including the protocol and interpretation of the PCR test results,
  • Description of external conditions (temperature) of validation,
  • Determination of the tested method parameters and acceptance criteria.

Carrying out the research process including PCR reaction to determine the following parameters:

  • Reported range and linearity test for quantitative test,
  • Analytical sensitivity,
  • Determination of the limit of detection (LOD), including the limit of detection (DL) and the limit of quantification (QL).
  • Precision, repeatability and reproducibility,
  • Analytical specificity,
  • Testing for detectability of other types and interference,
  • Clinical specificity testing.

Statistical analyzes performed with the Statistica software:

  • calculation of mean values,
  • coefficients of variation (CV),
  • standard deviation (SD),
  • confidence intervals,

for values obtained i) within-run, ii) intra-day, iii) day-to-day. The second- and third-order polynomials, ANOVA tests, and Fischer’s post-hoc test were used to confirm statistical significance. Criteria were applied according to which the CV value should not exceed 15%, while for samples with low concentrations the CV value may reach 20%.

………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….

Faza B+R

Metoda badania HPV16 w osoczu opiera się na wykorzystaniu krwi, w której znajduje się DNA pochodzący z guza. Podczas kancerogenezy, w której głównym czynnikiem onkogennym jest wirus HPV16, powstaje komórka nowotworowa zwierająca fragmenty DNA HPV16. W każdej komórce nowotworowej DNA HPV16 jest w licznych kopiach formy episomalnej (DNA wirusa w nienaruszonej formie kolistej) lub integruje z genomowym DNA (forma zintegrowana) lub dochodzi do powstawania hybrydowych episomów powstałych z wcześniej zintegrowanego DNA (zawierają DNA wirusa i DNA ludzkie). Wobec tego każda komórka rakowa wyposażona jest w dodatkowy materiał jakim jest DNA wirusa HPV16, a zmodyfikowany w ten sposób nowotwór nazywany jest rakiem zależnym od HPV.

Badania w Narodowym Instytucie Onkologii, Oddział w Gliwicach, wskazują, że raki zależne od HPV stanowią około 60% raków gardła środkowego oraz 80% raków odbytu. W latach 2013-2015 zaobserwowano w Polsce wzrost zachorowania na raki zależne od HPV, 5% dla raka gardła środkowego i 18% dla raka odbytu. W obu tych nowotworach najczęstszym genotypem jest typ 16 (HPV16).

Walidacja metody badawczej testu HPV16 w osoczu obejmuje opis warunków badania PCR, wykonanie procesu badawczego oraz analizy statystyczne.

Opis warunków badania:

  • Określenie przeznaczenia metody i jej zakresu,
  • Charakterystyka aparatury pomiarowo-badawczej oraz sprzętu podstawowego badanie PCR,
  • Charakterystyka jednorazowych materiałów zużywalnych,
  • Opis wzorców, kalibratorów, odczynników oraz materiału kontrolnego,
  • Opis badania, w tym protokół i interpretacja wyników badania PCR,
  • Opis warunków zewnętrznych (temperatura) walidacji,
  • Określenie testowanych parametrów metody oraz kryteria akceptacji.

Wykonanie procesu badawczego obejmującego przeprowadzenie reakcji PCR dla okreslenia następujących parametrów:

  • Raportowany zakres i badanie liniowości dla testu ilościowego,
  • Czułość analityczna,
  • Wyznaczenie limitu detekcji (LOD), w tym granicę wykrywalności (DL) i granicę oznaczalności (QL).
  • Precyzję, powtarzalność i odtwarzalność,
  • Specyficzność analityczna,
  • Badanie wykrywalności innych typów i interferencyjności,
  • Badanie specyficzności klinicznej.

Analizy statystyczne wykonane za pomocą oprogramowania Statistica:

  • obliczenia wartości średnich,
  • współczynników zmienności (CV),
  • odchylenie standardowe (SD),
  • przedziały ufności,

dla wartości otrzymanych i) w jednym badaniu, ii) w tym samym dniu, iii) miedzy dniami. Zastosowano wielomian drugiego i trzeciego rzędu, test ANOVA, test post-hoc Fischera dla potwierdzenia istotności statystycznej. Zastosowano kryteria według których wartość CV nie powinna przekraczać 15%, przy czym dla próbek o niskich stężeniach wartość CV może dochodzić do 20%.